Ocena aktywności neutrofili stymulowanych biomateriałem ceramicznym w warunkach in vitro

Abstract

Hydroksyapatyt (HA) jako materiał biozgodny i bioaktywny znajduje szereg zastosowań w różnych dziedzinach chirurgii i ortopedii. Zwiększa zdolność wgajania implantu, jednakże jego wadą jest tedencja do defragmentacji i uwalniania drobnych cząstek, które mogą aktywować leukocyty, szczególnie neutrofile we wczesnym etapie rozwoju reakcji zapalnej. Taka reakcja może spowodować poważne zaburzenia i przyczynić sie nawet do odrzucenia implantu. Celem pracy jest ocena aktywności neutrofili izolowanych z krwi świń stymulowanych in vitro dwoma rodzajami hydroksyapatytu: komercyjny Hydroksyapatyt i komercyjny Hydroksyapatyt + β – TCP. Z krwi świń pobranej podczas uboju do probówek z 3,8% roztworu cytrynianu sodu jako antykoagulantu, wyizolowano neutrofile i przygotowano ekstrakt peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Powyższy ekstrakt poporcjowano, zliofilizowano i przechowywano w temperaturze -70oC do czasu dalszych oznaczeń. Z kolejnej porcji świeżej krwi przygotowano zawiesinę neutrofili (czystość 95%). Równocześnie przygotowano biomateriały (Biomateriał 1 – Hydroksyapatyt (HA) firmy Biocer; Biomateriał 2 – Hydroksyapatyt + β-fosforan trójwapniowy (HA + β-TCP)). Próbki po 20mg biomateriałów nałożono w 2 powtórzeniach na płytkę 24 dołkową i zalano 500μl buforu PBS, pozostawiono na 2h do napęcznienia. Po tym czasie odciągnięto nadmiar PBS, który nie uległ wchłonięciu. Do każdego z 12 dołków nałożono po 40μg ekstraktu. Dokładny sposób rozmieszczenia próbek przedstawia rys. Nr 1. Płytkę umieszczono w inkubatorze CO2 na 4h. Po tym czasie oceniono aktywność wolnorodnikową neutrofili na podstawie wytwarzania tlenku azotu, oznaczoną z użyciem reakcji Griessa i wytwarzania anionorodnika ponadtlenkowego reakcją Confera. Odczyt powtórzono po 20 godzinach. W otrzymanych wynikach zaobserwowano, że stężenie azotynów w podłożu było większe w przypadku próby HA + β-TCP + N niż w próbie zawierającej sam HA + N, a dodatek ekstraktu neutrofilowego nie zmienił znacząco otrzymanych wyników. Również wytwarzanie anionorodnika ponadtlenkowego było większe po stymulacji HA+ β-TCP niż czystym HA. Można zatem wywnioskować, że zwiększona aktywność neutrofili zaobserwowana w hodowlach stymulowanych HA + β-TCP wynika z stymulujących właściwości TCP jako dodatku do HA.